QUESTIONING THE DOGMA IN THE CENTRAL DOGMA PENN STATE - PowerPoint PPT Presentation

QUESTIONING ¡THE ¡DOGMA ¡ IN ¡THE ¡ CENTRAL ¡DOGMA ¡ PENN ¡STATE ¡iGEM ¡TEAM ¡

Introduction • Scenarios that the Central Dogma does not answer • Answers are needed for rational design Transcription Initiation Translation Initiation Translation Elongation

Bidirectional Promoters Transcription Initiation

The Background • Normal ¡promoter ¡sequences ¡contain ¡two ¡ hexamers ¡ – Bind ¡to ¡σ ¡factor ¡ – Control ¡direc9on ¡of ¡transcrip9on ¡ • Bba_J23102 ¡ – 5’ ¡ ¡G TTGACA GCTAGCTCAGTCCTAGGT ACTGTG CTAGCT ¡ ¡3’ ¡ Hexamer ¡I ¡ Hexamer ¡II ¡ mRNA ¡ -­‑1 ¡ +1 ¡ -­‑10 ¡ -­‑35 ¡

What if… • the ¡promoter ¡is ¡palindromic? ¡ – which ¡direc9on ¡is ¡transcribed? ¡ ¡ • palindromic ¡promoter: ¡ – TAAC TTGACAATTATA AAAAAAAAA TATAATTGTCAA ATATTCA ¡ Hexamer₁ ¡I ¡ Hexamer₂ ¡I ¡ Hexamer₁ ¡II ¡ Hexamer₂ ¡II ¡

The Design 1. ¡ 2. ¡

The Design Palindromic ¡Sequences ¡ ¡ • Bba_K933004 ¡ – TAAC TTGACAATTATA AAAAAAAAA TATAATTGTCAA ATATTCA ¡ • Bba_K933005 ¡ – TAAC AACTGTATTATA AAAAAAAAA TATAATTGTCAA ATATTCA ¡ • Bba_K933006 ¡ – ATAAC TTGACAATTATA AAAAAAAAAA AGCCGGTGTCAA ATATTCA ¡

Normalization of Data • RFP ¡and ¡GFP ¡are ¡expressed ¡unequally ¡ ¡ • Calculated ¡constant ¡ K ¡ ¡to ¡compare ¡fluorescence ¡values ¡

The Results 12000 ¡ Control ¡BBa_K933003 ¡ BBa_K933003 ¡ ¡ 10000 ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ (BBa_J23102) ¡ 8000 ¡ 6000 ¡ II ¡ I ¡ 4000 ¡ 2000 ¡ Direc)onal ¡Value: ¡ 0 ¡ 0.969 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡ Bba_K933004 ¡ ¡BBa_K933004 ¡ ¡ 20000 ¡ 18000 ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ 16000 ¡ 14000 ¡ ¡II ¡ ¡I ¡ ¡II ¡ I ¡ 12000 ¡ 10000 ¡ 8000 ¡ 6000 ¡ Direc)onal ¡Value: ¡ 4000 ¡ 2000 ¡ 0 ¡ 0.701 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

The Results 16000 ¡ Bba_K933005 ¡ BBa_K933005 ¡ ¡ 14000 ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ 12000 ¡ 10000 ¡ ¡II ¡ ¡I ¡ ¡II ¡ I ¡ 8000 ¡ 6000 ¡ 4000 ¡ Direc)onal ¡Value: ¡ 2000 ¡ 0.885 ¡ 0 ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡ 30000 ¡ Bba_K933006 ¡ 25000 ¡ BBa_K933006 ¡ ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ ¡ 20000 ¡ ¡II ¡ ¡I ¡ ¡II ¡ I ¡ 15000 ¡ 10000 ¡ Direc)onal ¡Value: ¡ 5000 ¡ 0.969 ¡ 0 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

The ¡Results ¡ 7000 ¡ Bba_J23114 ¡ BBa_J23114 ¡ 6000 ¡ Rela9ve ¡fluorescence ¡ 5000 ¡ II ¡ I ¡ 4000 ¡ 3000 ¡ Direc)onal ¡Value: ¡ 2000 ¡ 0.820 ¡ 1000 ¡ 0 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ TECANM1000: ¡Spectrophotometry ¡: ¡Bulk ¡fluorescence ¡per ¡OD600 ¡ ¡

The Conclusion • Promoter ¡sequences ¡can ¡be ¡bidirec9onal ¡ • Placement ¡of ¡hexamer ¡sequences ¡effects ¡ ¡ – direc9onality ¡ – expression ¡rate ¡ • Watch ¡out ¡for… ¡ promoters ¡with ¡palindromes ! ¡

Mul9ple ¡Start ¡Codons ¡ Transla9on ¡Ini9a9on ¡

What ¡if… ¡ • Two ¡start ¡codons ¡exist ¡on ¡a ¡single ¡mRNA ¡strand ¡ • Which ¡is ¡chosen ¡for ¡ini9a9on? ¡ ? ¡ ? ¡ ? ¡ ATG ¡ ATG ¡ ATG ¡ NN ¡ NNNN ¡ RBS ¡

The Design N ¡ weak ¡RBS ¡ RFP ¡ sfGFP ¡ • Designed ¡with ¡low-­‑ini9a9ng ¡RBS ¡ sequence ¡ • Removal ¡of ¡all ¡interim ¡stop ¡codons ¡ ATG ¡ ATG ¡ [(n*3N)+1] ¡ within ¡both ¡frames ¡of ¡reference ¡

The Results • Construct ¡for ¡start ¡codons ¡within ¡7 ¡nucleo9des ¡ ¡ • Calculated ¡approximate ¡rela9ve ¡fluorescence ¡using ¡ K ¡ constant ¡from ¡promoter ¡data ¡ Fluorescence ¡of ¡sfGFP ¡and ¡RFP ¡by ¡ 12000 ¡ ini9ated ¡by ¡start ¡codons ¡ Rela9ve ¡fluorescence ¡ 8000 ¡ 4000 ¡ 0 ¡ Bulk ¡fluorescence ¡per ¡OD600 ¡

The Conclusion • Ribosome ¡overwhelmingly ¡bound ¡to ¡sfGFP-­‑ ini9a9ng ¡start ¡codon ¡ • Tes9ng ¡with ¡varying ¡RBS ¡transla9on ¡ini9a9on ¡ rates ¡and ¡lengths ¡between ¡codons ¡ • Watch ¡out ¡for… mul)ple ¡start ¡codons! ¡

Codon ¡Op9miza9on ¡ Transla9on ¡Elonga9on ¡

The Background • Codon: ¡3 ¡nucleo9des ¡that ¡ Threonine ¡ ACT ¡ ACC ¡ code ¡for ¡an ¡amino ¡acid ¡ ACA ¡ ACG ¡ • Which ¡codon ¡sequence ¡is ¡ Alanine ¡ GCT ¡ GCC ¡ the ¡best ¡for ¡each ¡amino ¡ GCA ¡ GCG ¡ acid? ¡ Proline ¡ CCT ¡ CCC ¡ CCA ¡ CCG ¡

What ¡if… ¡ • Rare ¡codons ¡are ¡translated? ¡ – Ribosomes ¡read ¡rare ¡sequence ¡ • Charged ¡tRNA ¡not ¡as ¡available ¡with ¡matching ¡ codon ¡ – Transla9on ¡will ¡be ¡inhibited ¡ ¡ – mRNA ¡degrada9on ¡may ¡result ¡

The Design RBS ¡ RBS ¡ GFP ¡ mCherry ¡ AHL ¡leader ¡ 6 ¡codon ¡repeat ¡sequence ¡ sequence ¡ • GFP: ¡reference ¡constant ¡ • RFP ¡will ¡vary: ¡amount ¡expressed ¡indicates ¡codon ¡op9miza9on ¡

The Results Compared ¡with ¡ previous ¡data* ¡ Threonine ¡6 ¡repeat-­‑GFP ¡and ¡mCherry ¡ • Using ¡9 ¡repeats-­‑ Expression ¡ similar ¡results ¡ 80 ¡ 70 ¡ • GFP ¡differences ¡ 60 ¡ 50 ¡ Threonine ¡9 ¡Repeat ¡ 40 ¡ 30 ¡ 20 ¡ 10 ¡ 0 ¡ ACT ¡ ACC ¡ ACA ¡ ACG ¡ *Dr. ¡Mike ¡Speer: ¡currently ¡at ¡Cargill ¡

The Conclusion • Based ¡on ¡previous ¡results ¡and ¡our ¡6 ¡repeat ¡ results ¡for ¡Threonine ¡ ¡ – ACG ¡is ¡op9mal ¡codon ¡for ¡DH10B ¡E. ¡coli ¡during ¡ exponen9al ¡growth ¡ • Watch ¡Out ¡For… rare ¡codons! ¡ *Welch, ¡Mark, ¡Sridhar ¡Govindarajan, ¡Jon ¡Ness, ¡et ¡al. ¡"Design ¡Parameters ¡to ¡Control ¡Synthe9c ¡Gene ¡Expression ¡in ¡Escherichia ¡coli." ¡ PLoS ¡ONE . ¡4.9 ¡(2009): ¡ 1-­‑10. ¡Print. ¡

Educational Outreach • Presented ¡at ¡local ¡high ¡school ¡ • Molecular ¡Biology ¡Anima9on ¡ • Prezi ¡Presenta9ons ¡ • Americas ¡East ¡Jamboree ¡high ¡ school ¡presenta9on ¡

Ques9oning ¡the ¡Dogma ¡ in ¡the ¡Central ¡Dogma ¡ • Watch ¡out ¡for ¡Palindromic ¡Promoters ¡ – They ¡transcribe ¡in ¡both ¡direc9ons! ¡ • Watch ¡out ¡for ¡ Mul)ple ¡Start ¡Codons ¡ – They ¡may ¡translate ¡the ¡wrong ¡protein! ¡ • Watch ¡out ¡for ¡ Rare ¡Codons ¡in ¡Coding ¡Sequences ¡ – They ¡will ¡slow ¡down ¡transla9on! ¡

Asribu9ons ¡ • Dr. ¡Tom ¡Richard ¡lab ¡at ¡Penn ¡State ¡ – Mike ¡Speer ¡ • Dr. ¡Howard ¡Salis ¡lab ¡at ¡Penn ¡State ¡ – RBS ¡calculator ¡sotware ¡

Our ¡Team ¡