Scientific results of WISDOM first data challenges on malaria and - - PowerPoint PPT Presentation

▶
scientific results of wisdom first data challenges on
SMART_READER_LITE
LIVE PREVIEW

Scientific results of WISDOM first data challenges on malaria and - - PowerPoint PPT Presentation

Aug 22, 2023 34 likes •274 views

Scientific results of WISDOM first data challenges on malaria and avian flu Young-Min Kim (professor Doman Kim) Chonnam National University, Korea On the behalf of the WISDOM collaboration http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz

slide-1
SLIDE 1

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Scientific results of WISDOM first data challenges on malaria and avian flu

Young-Min Kim (professor Doman Kim) Chonnam National University, Korea On the behalf of the WISDOM collaboration

slide-2
SLIDE 2

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Searching for new drugs

  • Drug development is a long (10-12 years) and expensive

(~800 MDollars) process

  • In silico drug discovery opens new perspectives to speed it

up and reduce its cost

Target Identification and validation

  • 2/5 years
  • 30% success rate

Lead identification

  • 0.5 year
  • 65% success rate

Lead

  • ptimization
  • 2/4 years
  • 55% success rate

Target discovery Lead discovery Gene expression analysis, Target function prediction, Target structure prediction De novo design, Virtual screening Virtual screening, QSAR Target Identification and validation

  • 2/5 years
  • 30% success rate

Lead identification

  • 0.5 year
  • 65% success rate

Lead

  • ptimization
  • 2/4 years
  • 55% success rate

Target discovery Lead discovery Gene expression analysis, Target function prediction, Target structure prediction De novo design, Virtual screening Virtual screening, QSAR

From Dr. Vincent Breton

slide-3
SLIDE 3

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

A first step towards in silico drug discovery: virtual screening

  • In silico virtual screening

– Starting from millions

  • f compounds, select

a handful of compounds for in vitro testing – Very computationally intensive but potentially much cheaper and time effective than typical in vitro testing

Computational demand

Starting compound database Starting target structure model Filter, preparation Docking, scoring, filter Predicted binding models Post-analysis Define binding site Visual evaluation Visual evaluation Visual evaluation Compounds for assay

Protein surface Ligand

Water

Protein surface Ligand

Water

From Dr. Vincent Breton

slide-4
SLIDE 4

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Wisdom I workflow for malaria inhibitor development

FLEXX AUTODOCK

Molecular docking Molecular dynamics Re-ranking MMPBSA-GBSA Complex visualization In vitro tests Catalytic aspartic residues Catalytic aspartic residues 4 H bonds

Amber

Ligand Ligand

2 Hydrogen Bonds Ligand Catalytic aspartic residues

AMBER CHIMERA WET LABORATORY

Millions 5000 180 30 From Ana & Vinod

slide-5
SLIDE 5

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Inhibition of Plasme psin II

Ar e as with limite d r isk No malar ia Ar e as whe r e malar ia transmission oc c ur s

slide-6
SLIDE 6

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Plasme psin Plasme psin II II

  • Ma la ria , a dre adful dise a se is c a use b y pro to zo a n pa ra site , plasmo dium.
  • Plasmo dium spe c ise : Plasmo dium falc iparum, P. vivax, P. malariae , P. o vale
  • One o f the c ruc ia l drug ta rg e ts in ma la ria a re pla sme psin.
  • Pla sme psins a re invo lve d in the he mo g lo b in de g ra da tio n inside the fo o d va c uo le

during the e rythro c ytic pha se o f the life c yc le .

  • T

e n diffe re nt iso fo rms (PMI , I I , I I I , I V, V, VI , VI I , I X, X a nd HAP)

  • Pla sme psin I

I is re spo nsib le fo r initia l a tta c k o n the he mo g lo b in α-c ha in b e twe e n the re sidue s Phe 33 and L

e u 34, in the hing e re g io n.

He moglobin (Hb) L ar ge fr agme nts Small pe ptide s Amino ac ids

Plasme psins I, II, IV and HAP F alc ipain, plasme psin F alc ilysin, aminope pdidase s

He me He matin He mozoin

  • xida tion

polyme riza tion (malarial pigme nt)

<He moglobin de gr adation in Plasmodium fac ipur

am>

slide-7
SLIDE 7

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Pe pstatin A

  • Ge ne ra l inhib ito r o f aspa rtic pro te a se s
  • inhib itio n o f he mo g lo b in de g ra da tio n

b y e xtra c ts o f dig e stive va c uo le s o f P.

fac iparum (Phe 33 and L

e u34 in the hing e re g io n o f the α-c ha in)

Pe pstatin Pe pstatin A vs. Ne w pote ntial A vs. Ne w pote ntial plasme psin plasme psin inhibitor s inhibitor s

slide-8
SLIDE 8

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

E xpr e ssion and pur ific ation of r e c ombinant plasme psin II

M 1 2

66 44 31 kDa 37 kDa

L a ne 1: c e ll supe rna ta nt a fte r tre a tme nt o f 8 M ure a L a ne 2 : purifie d e nzyme using Q-Se pha ro se c o lumn

  • I

PT G induc tio n (1 L ) : g ro wn to a n OD600 o f 0.5 a t 37oC

a dditio n o f I

PT G 18oC

  • Pla smids na me : rPMI

I(pla sme psin I I ),

  • ve c to r : pE

T

  • 3d (4,640 b p, se le c tio n ma rke r : a mpic illin)
  • tra nsfo rma tio n o f E

. c o liBL

21(DE 3)

Binding b y 20 mM T ris b uffe r pH 8.0 E a c h fra c tio n: 5 ml Wa shing b y sa me b uffe r E a c h fra c tio ns: 30 ml E lutio n b y fro m 0 to 1 M Na Cl in sa me b uffe r E a c h fra c tio n: 3 ml

0. 5 1 1. 5 2 2. 5

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160

Fr act i

  • n

N o . 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1 1. 2

OD280 NaCl concentration

Binding Washing Elution from 0 M to 1 M

Q-Se phar

  • se c hr
  • matogr

aphy

On UV

slide-9
SLIDE 9

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Malar ia Aspar tyl pr

  • te inase F

RE T assay

DABCYL

  • Glu-Ar

g-Nle -Phe -L e u-Se r

  • Phe -Pr
  • -E

DANS

c le ava ge site

  • Synthe tic pe ptide de sig ne d to mimic the c le a va g e site pre se nt in he mo g lo b in

Pe ptide

C NH

Dye O

Prote ase

Pe ptide

COOH + H

2N

Dye

<Carboxype ptidase re ac tion of “pe ptide - CO- NH- Dye ” fluoroge nic substr ate > 1 2 3 1 2 3 Be fore re a c tion Afte r re ac tion

la ne 1 : F RE T sub stra te (10 μM) la ne 2 : a c tive rPM2 la ne 3 : F RE T sub stra te + a c tive rPM2

slide-10
SLIDE 10

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

r PM2 ac tivity assay

Plasme psin assay

  • Pla sme psin ac tiva tio n : rPMI

I+ a ssa y b uffe r (pH 4.5) + 1 μl inhib ito r (100 nM)

37oC, 30 min induc tio n

  • F

RE T assa y 1) Ac tiva te d e nzyme (75 ng ) + 3 μM sub stra te pe ptide (50 μl fina l vo lume )

30 min inc ub a tio n a t ro o m

te mpe ra ture 2) me a suring using a fluo re sc e nc e mic ro pla te re a de r (e xc ita tio n 405 nm, e missio n 510 nm) de te c tio n o f fluo re sc e nc e spe c tra o r UV spe c tra

I F I Ra nk NI 3418 PA 1059 1 2200

23

2 2074

22

3 2981

27

4 1439

16

5 2485

26

6 1297

11

7 1230

9

8 1402

13

9 3534

30

10 3430

28

11 1531

17

12 1808

21

13 2209

24 14 1025 2

I F I Ra nk 15 1760

20

16 1214

8 17 1046 4

18 1173

7 19 1059 5 20 1026 3 21 1016 1

22 2322

25

23 1414

14

24 1642

19

25 1253

10

26 1341

12 27 1074 6

28 1426

15

29 1631

18

30 3499

29

I – Inhibitors; NI – w/o inhibitor PA – w/ pepstatin A (reference) * Red valued inhibitors – contain own fluorescence.

Similar or better inhibitions : 6/30 compounds [21,14, 20, 17, 19, (27)]

slide-11
SLIDE 11

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Inhibition te st (he moglobin de gr adation)

No detection of hemoglobin degradation fragments except inhibitors of 5, 9, 13, 21, 23, 24, 29 P – Pepstatin A, C – w/o Inhibitor, H – Hemoglobin only

H C P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 H H C P 24 25 26 27 28 29 30

1. Re c o mb ina nt pla sme psin I I (75 ng ) + a ssa y b uffe r (pH 4.5) + 1 μl inhib ito r

37oC, 30 min inc ub a tio n (pre - ac tivation) (500 μM)

2. rPMI I

  • inhib ito r c o mple x + Huma n he mo g lo b in (10 μg )

37oC, 3 hr inc ub a tio n

  • 3. Digestion was terminated by addition of SDS-PAGE loading dye
  • 4. SDS-PAGE analysis on a 15% polyacrylamide gel
slide-12
SLIDE 12

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

WHO homepage

Development of Neuraminidase Inhibitor by Grid-Enabled Virtual Screening

slide-13
SLIDE 13

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

HA

Neuramindase (NA) and replication of virion An enzyme, cleaves host receptors help release of new virions

NA

Modeling HTS against Inf-A NA on Grid

From Prof. Ying-Ta Wu

slide-14
SLIDE 14

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

GH Families by similarity of amino acid sequence

http://www.cazy.org/ Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999)

Classification of neuraminidase:

http://www.cazy.org/

slide-15
SLIDE 15

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Neuraminidase from Clostridium perfringens ATCC 13124 (Available 3D structure) Streptococcus pneumoniae ATCC 6322, Salmonella typhimurium TA262 Vibrio cholera N16961…. Neuraminidase from influenza A virus and B virus about 6427 (Available 3D structure)

…..mainly Pathogenic bacteria …..mainly Influenza virus

Glycoside Hydrolase Family 33 Glycoside Hydrolase Family 34

slide-16
SLIDE 16

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Evaluate potential targets and model their 3D structures Prepare the large-scale docking using Autodock. Development of the grid environment for a large-scale deployment.

The deployment

H5N1

From Prof. Ying-Ta Wu et al.

slide-17
SLIDE 17

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Elution by from 25 to 500 mM IMD Each fraction: 15 ml

Ni-NTA column chromatography

  • E. coli Rosseta ( DE3 ) haboring-Neu1-23d

LB media (5 ml) containing Ampicilline 50 ug/ml Cultured until OD600＝0.5 at 37oC Cool down in ice Add IPTG Cultured more …. 16oC For purification, 4 L culture. detect on the UV llumination

Neuraminidase

GH family 34/H5N1

Preparation of neuraminidase 1:

sp Neu1 : 1350 bp

SDS-PAGE (12%) of Neu1

SM SM S T 20.6 34.8 49.1 80 124 209 kDa

0.2 0.4 0.6 0.8 5 10 15 20 25 30 35 40 Fraction nos abs280

6 8 12 10 50kDa 14 8

After 4 h

slide-18
SLIDE 18

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

  • E. coli Rosseta ( DE3 ) haboring-CP42

LB media (5 ml) containing Ampicilline 50 ug/ml Cultured until OD600＝0.5 at 37oC Cool down in ice Add IPTG Cultured more …. 18oC For purification, 1 L culture.

GH family 33/ C. perfringens Neuraminidase

Preparation of neuraminidase 2:

0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 20 30 40 Fraction nos. abs280 Elution by from 25 to 500 mM IMD Each fraction: 15 ml

Ni-NTA column chromatography

SDS-PAGE (10%) of CP42

SM 8 14 12 10 S CE 42kDa 20.6 34.8 49.1 80 124 209 kDa

CP42

detect on the UV illumination/ Florescent at excitation at 332 nm emission 448 nm

Neuraminidase

Expression vector

slide-19
SLIDE 19

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Spectrofluorometric detector RF-551 362 nm excitation and 448 nm emission wavelengths 4-Methylumbeliferyl-N-acetyl-α-D-neuramininic acid ammonium salt [4MU-NANA]; Substrate

Recombinant Neuraminidase

Assay for neuraminidase activity 2: 4-MU-NANA

Red Blue

Inhibition

First screening (200 nmol) Second screening (2 nmol) Kinetic study

slide-20
SLIDE 20

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

CP42 in GH 33 Neu1 in GH 34

Screening of neuraminidase: First screening

First Screening 116/308 compounds – 38% First Screening 42/169 compounds – 25%

slide-21
SLIDE 21

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Neu1 in GH 34 CP42 in GH 33

Screening of neuraminidase: Second screening

Second screening 62/308 compounds-20.1% (Higher inhibition activity compare to Tamiflu) Second screening 0/169 compounds-0%

slide-22
SLIDE 22

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Measure at excitation 362 nm and emission at 448 nm 4MU-NANA : 20 μM/RM Neuraminidase : 10 mU/reaction

Rank Compounds Relative activity of Neu1

1 113 67 2 16 72 3 6 73 4 155 74 5 78 78 63 Tamiflu 100 On UV

slide-23
SLIDE 23

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

GH family 34/ N1Mutation

Preparation of H5N1 mutant enzymes:

  • 1. FPCR
  • 2. Second

PCR Megar primer PCR

  • 3. Cloning

E119G/A/D/V H274Y/F R292K N294S 7 mutants

From Prof. Ying-Ta Wu et al.

slide-24
SLIDE 24

전 남 대 학 전 남 대 학 교

http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 기능성 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실

Enzyme in vitro tests:

Hee-Kyoung KANG (Plasmepsin) Chonnam National University, Korea

Nuraminidase, Plasmepsin In silico data challenge and analyses:

Academia Sinica, Taiwan Hurng-Chun LEE, Simon C. LIN (Grid Computing Center) Ying-Ta WU, Chon-Chen LEE (Genomic Research Center) CNRS-IN2P3-LPC, Clermont-Fd, France Vincent BRETON, Nicolas JACQ, Jean SALZEMANN Vinod KASAM, Ana DA COSTA, Vincent BLOCH Yannick LEGRE HealthGrid Nicolas SPALINGER SCAI-Fraunhofer Institute, Germany Martin HOFMANN Modena University, Italy Giulio RASTELLI KISTI, Korea

Ok-Hwan Byeon, Soon-Wook Hwang

Acknowledgements